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外泌体微泡作为细胞间信号传导的重要媒介，越来越多的研究揭示其作为重大疾病生物标志物的临床价值。当前外泌体微泡快速，高通量，多参数的主流分析方法仍为流式分析法。流式分析法主要依赖散射光或者荧光设定分析阈值，划门分析。然而由于外泌体微泡体积远小于细胞，散射光信号弱，传统流式散射光检测灵敏度低，需借助荧光标记才可分析外泌体微泡。其中，非特异荧光标记为外泌体微泡总量分析较为普遍的方法。
近日de Rond等人系统研究适合外泌体微泡非特异标记的理想标志物，详细分析Calcein AM， Calcein violet， CFSE， Di-8-ANEPPS和Lactadherin（另外，因Annexin V和Lactadherin同样结合膜磷脂成分，并且依赖于钙离子，无法适用于血液等样品直接标记，膜磷脂结合效率远低于Lactadherin，故不在此研究范围内）等不同类型标记物。因不同标志物标记外泌体微泡效率明显不同，并且对蛋白质聚集体，脂蛋白，细胞碎片等物质的干扰敏感性不同，其效能比较分析需要非常严格的对比信息方有意义。de Rond等人借用Apogee纳米流式超高的散射光灵敏度和分辨率，作为不同标志物标记效能分析的参考标准，结合MCF7细胞上清和血小板外泌体微泡样本，详细比较了上述5种标志物识别外泌体微泡的效能情况。
研究统计发现，Di-8-ANEPPS, Lactadherin和超灵敏散射光可以检测到 的EpCAM+ MCF7 外泌体微泡（图1）；Lactadherin和超灵敏散射光可分别检测到33%和d 61% 的血小板 CD61+外泌体微泡（图2）。只有在血小板蛋白质杂志去除后，Di-8-ANEPPS才可以特异识别结合外泌体微泡。Calcein AM， Calcein violet和 CFSE则是检测灵敏度相对较差或极易引起集群检测问题的标志物。因此，截止目前还没有能够同时满足：标记所有外泌体微泡，特异性足够高，与抗体标记兼容，适用生物体液样本直接标记，标记检测时间低于8小时等条件的非特异标志物。 然而，该研究也反映出针对不同外泌体微泡样品，选择合适的荧光标志物，结合Apogee纳米流式超灵敏散射光，仍会是当前外泌体微泡流式分析的选择，快速，精准，可靠。
图1，EpCAM+ MCF7 外泌体微泡散射光和荧光标志物流式分析
图2，血小板外泌体微泡散射光和荧光标志物流式分析
Apogee超灵敏纳米流式细胞仪是英国Apogee Flow厂家研发，它独有的光学设计使其可检测70nm颗粒，10nm分辨率。英国Apogee Flow技术早前广泛为美国军方用于战场上快速微生物检测。继之前北京中科院微生物所和北京计量研究所引入了Apogee流式细胞仪为微生物做快速检测和定量，上海第二军医大学转化医学中心也成功安装了超灵敏Apogee A50-Micro Plus型号来进行外泌体微泡的研究。此外，每年在胞外囊泡大会上，更有不少科学家展示的研究成果均采用Apogee超灵敏纳米流式细胞仪来进行胞外囊泡研究。2015年欧洲国家计量研究协会评定英国Apogee超灵敏纳米流式细胞仪为在微泡（<100nm）检测中灵敏的系统。
参考文献
de Rond, Leonie, et al. "Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry." Clinical chemistry 64.4 (2018): 680-689.
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